生物材料的治療和診斷應用正在激增，包括用于直接治療藥物遞送的抗體和抗體藥物偶聯物，用于藥物遞送新基因療法的病毒，以及用于藥物遞送復雜治療信號劑的細胞外囊泡。值得注意的是，每一類材料都包含一個具有納米級尺寸的關鍵組件，在某些情況下包括運載工具本身，在許多情況下還包括不需要的聚集體。在所有的開發階段，對這些材料中所需的和假的納米顆粒成分進行定量，對于正確評估有效性和確保產品安全性是至關重要的。因此，亞微米尺寸范圍內生物納米顆粒的精確物理表征是給藥物遞送行業越來越重要的要求。

而生物納米顆粒的粒徑與濃度測量始終對設備的要求越來越高。

生物納米顆粒的精確測量

一般來說，隨著亞微米顆粒的尺寸減小，其測量信號降低到測量儀器的檢測極限，其精確測量變得越來越困難。雖然低溫透射電子顯微鏡(CryoTEM)仍然是確定納米顆粒尺寸的金標準，該技術的亞納米尺寸分辨率使它作為一種偶爾的分析工具非常強大，但這種技術的成本和速度慢使其不適合常規使用。歷史上，亞微米尺寸范圍內較為常用的粒子測量技術是光學技術，如動態光散射(DLS)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和流式細胞術(FC)。

然而，生物納米顆粒有三個共同的特征，這使得它們非常難以使用光學技術進行測量，主要是因為這些測量依賴于檢測從這些非常小的粒子中散射的光。

首先，散射光的強度顯著降低，與直徑的六次方相關。因此，100納米粒子的散射光比1µm粒子少100萬倍。這種依賴性，再加上光學傳感器有限的動態范圍，限制了可以在單個樣品中測量的實際尺寸范圍，并使小粒子的檢測更具挑戰性。

其次，大多數生物材料的物理組成導致產生的粒子折射率與周圍的介質相似，通常是水介質，在某些情況下，指數相差只有幾個百分點。散射光強度與這個指數差（也稱為對比度）成正比，因此可以導致信號再次減少10到100倍。低折射率對比度和小尺寸的結合顯著削弱了從生物納米粒子散射的光的強度，從而限制了光學測量技術對這些亞微米粒子的靈敏度。

最后，生物納米顆粒的復雜起源（例如，聚集過程或從細胞中脫落）產生了具有不同的材料組成和廣泛的顆粒尺寸的真實樣本。高度的多分散性在這些樣品地方重大負擔大小分辨率的情況下，測量散射光從單一粒子，并提出了一個不可逾越的障礙，執行集成測量的所有粒子入射光路徑和不能容忍顯著的多分散性。

測量納米顆粒大小和濃度的非光學技術為這些光學技術提供了一種強有力的替代方法。最常見的是基于一種被稱為電阻脈沖傳感(RPS)的電學測量技術，在過去被稱為庫爾特原理，以該技術的發明者華萊士·庫爾特原理命名。

RPS是一種被證明的測量大顆粒(>1µm)大小和濃度的技術，幾十年來一直是全血細胞計數的金標準。RPS非常適合用于生物納米顆粒的測量，原因有三：

1。檢測信號隨粒子體積呈線性關系，因此在單個樣本中可以測量的動態尺寸范圍要大得多。

2. RPS的測量與粒子的材料組成無關，因此不像光學技術那樣遭受靈敏度的損失。

3. 由于粒子在RPS中以高精度單獨測量，高多分散性不是一個重要的問題。可以直接在復雜的介質中直接進行顆粒測量，如血清、尿液和其他生物液體，這些液體的多分散性會混淆光散射技術。

那么，為什么RPS的使用在過去僅限于大粒子呢？RPS要求所有被測量的粒子都通過物理收縮進行檢測，并且必須減少物理收縮的尺寸才能檢測到更小的粒子。現實世界的樣品包含的顆粒濃度大于納米顆粒測量所需的小收縮尺寸。因此，在簡單的RPS實現中，樣品中的大顆粒會導致收縮的頻繁阻塞，并禁止了該技術的實際應用。

2009年，為了早期嘗試克服這一障礙，Izon科學公司（克賴斯特徹奇，新西蘭）開發了用于RPS測量的qNano。Izon的實現設置了可變形膜(“可調”RPS)的收縮，可以調整，允許阻塞在恢復測量之前通過。雖然該技術已被許多學術出版物引用，但它在需要高通量和交鑰匙操作的工業應用中的部署受到了限制。

最近，Spectradyne將一種不同的RPS方法商業化，顯著提高了在工業環境下對真實樣品進行常規納米顆粒分析技術的實用性。Spectradyne公司的nCS1儀器是RPS(MRPS)的微流控實現，利用半導體行業的制造技術，將一些流控特性納入一次性分析盒，允許納米顆粒分析，同時顯著減少堵塞事件。MRPS可以直接測量高度多分散的生物納米顆粒樣品，如蛋白質聚集物、血清、尿液和細胞外囊泡的粗制劑，并正在被制藥行業的著名研究人員所采用。

不管儀器的基本工作原理如何，所有儀器最終都受到其固有靈敏度和噪聲的限制。但隨著生物納米顆粒的重要性在藥物輸送行業，監管機構如美國FDA越來越認識到使用一套完整的描述方法的重要性，由蘇珊·科什納，博士，在2012年的談話題為“監管期望聚合和粒子的分析”，包括方法正交于傳統的光技術。MRPS代表了一種實用且易于使用的替代方案。

MRPS測量實例

下面給出了三個測量例子，說明了上述考慮在現實世界的給藥行業應用中的重要性。首先，比較三種不同的粒子分析方法(NTA、CryoTEM和MRPS)對簡單的胞外囊泡制備進行測量，以顯示使用正交測量技術的重要性。其次，用NTA和MRPS測量一個聚集的蛋白樣本，并說明了上述儀器的限制如何適用于不同類別的樣本。最后，利用一系列應激蛋白樣本的測量來證明MRPS較小的顆粒檢測極限如何能夠更早地檢測蛋白質聚集。

例1：除非仔細純化，否則細胞外囊泡(ev)樣品自然表現出顆粒濃度與顆粒大小的近似冪律分布。如此寬的粒徑分布提供了一個很好的機會來評估不同測量技術在相關樣品類型的綜合尺寸范圍內的靈敏度。對于這個測量示例，我們使用MRPS、NTA和CryoTEM分析了來自人類無細胞尿液中的一個簡單的ev樣本（圖1）。

使用三種正交技術：MRPS、CryoTEM和NTA測量從人血清中分離的細胞外囊泡。與MRPS和金標準CryoTEM等正交技術相比，光學技術對小的、弱散射的生物納米顆粒的靈敏度損失變得很明顯。

MRPS顯示了濃度與顆粒大小的明顯冪律依賴性，并延伸到50nm，這是本測量中使用的分析盒的檢測極限。重要的是，MRPS的測量結果與CryoTEM的測量結果非常一致，這是測量這類樣品中顆粒大小和相對濃度的金標準。

NTA的測量結果突出了NTA技術在檢測這類樣品中的小顆粒方面的局限性。NTA明顯低估了較小顆粒的濃度，與CryoTEM的結果變得明顯，從200nm開始，在150nm以下顯著增加。NTA和CryoTEM之間的差異在150nm直徑以下擴展到幾個數量級。

因此，研究人員在解釋這些NTA數據時必須小心，特別是結果的剖面似乎表明在150nm左右的尺寸分布中存在一個峰值，這并不是粒徑分布的真正特征。只有在使用MRPS或CryoTEM等正交方法進行比較時，峰值才能被準確地識別為測量技術的人工產物，如本例中所述。不幸的是，不準確的基于光學的EV尺寸分布測量，如NTA測量，經常出現在文獻中，通常沒有正交技術，如MRPS或CryoTEM支持。

例子2：蛋白質聚集在聚集過程中，直徑為幾納米的蛋白質單體聚集成二聚體、三聚體，然后聚集成更大的顆粒，直徑可達幾十微米。這個過程產生了一種含有顆粒的高度多分散的混合物跨越直徑和濃度的許多數量級，具有物料濃度與顆粒大小的近似冪律分布。

在這個具體的例子中，在5 mg/mL的磷酸鹽緩沖鹽中制備了一個專有的蛋白質樣品，并在高溫下脅迫24小時以加速聚集過程。采用NTA和MRPS方法測量了樣品中的粒徑分布（圖2）。MRPS測量結果顯示了濃度對大小的預期冪律依賴性，并進一步表明冪律依賴性延伸到至少60nm，這是用于該測量的分析盒檢測的小尺寸極限。

當通過MRPS測量時，應激樣品中的蛋白質聚集物顯示了濃度與大小的預期冪律依賴性。NTA的靈敏度的大小范圍是明顯的，因為該方法低估了約150-450nm直徑以外的濃度。

在本例中也清楚地說明了光學技術的靈敏度限制。雖然NTA很容易檢測到樣品中約150-450nm之間的粒子，但在150nm以下，NTA報告的濃度急劇下降（注意縱軸上的對數尺度），可能由于這些較小的蛋白質聚集物的散射強度降低。由于這種濃度與尺寸的明顯下降，數據可能被錯誤地解釋為尺寸分布的峰值。如果不使用MRPS等正交技術來驗證粒度分布的真實性質，很多研究人員可能會被誤導。

例3：MRPS可以更早地檢測蛋白質聚集精確測量較小的生物納米顆粒，如用MRPS獲得的納米顆粒，可以為真實的藥物藥物遞送應用節省時間。在這個例子中，MRPS被用來量化應激藥物配方中的蛋白質聚集物。結果表明，通過檢測和分析較小顆粒的濃度，可以在過程中早期檢測到應力誘導的聚集。

一種專有生物藥物制劑的等分物被強調，時間從0分鐘（對照）到60分鐘不等，隨后使用MRPS來量化每個樣本中的聚集物（圖3）。數據非常清楚地顯示了預期的趨勢：隨著施加于樣品的應力量的增加，樣品中聚集物的濃度在所有顆粒大小中都在增加。

應激樣品中的蛋白質聚集顯示出隨著應激的增加而濃度增加的預期趨勢。對三個粒徑子范圍的濃度測量（插圖）表明，通過定量較小的聚集體，可以更早地檢測到應力對樣品的影響。

然而，重要的是，骨料濃度首先在小顆粒尺寸時增加，然后在大顆粒尺寸時增加。這種效應在數據中很明顯，如圖3中的插圖所示。當在r1到r3（分別為小顆粒到大）上測量濃度時，在第一個時間點，僅在10 min后，應力對樣品的影響是明顯的。這種行為與預期是一致的，因為蛋白質聚集必須在生長到大尺寸之前開始小，并為配方開發節省時間提供了重要的機會。

使用精確的方法來定量較小的納米顆粒，如MRPS，配方應力測試可以在很小部分的時間內進行，使用光學技術缺乏足夠的靈敏度來檢測較小的、早期階段的聚集體。在工業環境中，在過程中更快地獲得數據可以顯著提高過程效率。

隨著納米級生物材料的治療和診斷應用的激增，其準確的定量變得越來越重要。這篇文章表明，雖然普遍存在的，光學方法的納米顆粒分析必須在了解其局限性的情況下使用，并且結論應該得到正交測量技術的結果的支持。所引用的例子說明了由于光學技術的靈敏度限制所造成的人工制品可能會誤測復雜的生物納米顆粒樣品的真實組成。這些例子還表明，實用的技術，如MRPS，能夠精確地定量測量亞微米生物粒子，并在現實世界的制藥工業應用中提供了大量節省時間和金錢的機會。